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流式检测细胞表面抗原 流式细胞术同时检测BrdU与细胞表面抗原方法的改进

文章作者:小 巫 | 2019-10-09 09:36:37
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1、材料与方法 1.1 实验动物 SPF级Balb/c近交系小鼠,4周龄,体质量16~18g,雄性,购于上海斯莱克实验动物中心。 1.2 主要试剂 BrdU(5-Bromo-2'-Deoxyuridine)、Tritonx-100(Sigma公司);吐温-20、多聚甲醛

  1、材料与方法

  1.1 实验动物

  SPF级Balb/c近交系小鼠,4周龄,体质量16~18g,雄性,购于上海斯莱克实验动物中心。

  1.2 主要试剂

  BrdU(5-Bromo-2'-Deoxyuridine)、Tritonx-100(Sigma公司);吐温-20、多聚甲醛(国药试剂);无支原体胎牛血清(杭州四季青)、RPMI1640细胞培养基(Invitrogen公司);FITCMouseAn-ti-BrdU、FITC Mouse IgG1 КIsotype Control(BD公司);PE Mouse Anti-CD4、PE-Cy5 Mouse Anti-CD8(eBioscience);DNaseΙ(TaKaRa公司)等。

  1.3 主要仪器

  FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)。

  1.4 BrdU的给药方法和胸腺细胞悬液的制备

  检测前3h小鼠腹腔注射BrdU100mg/kg,每只小鼠注射两次,间隔1.5h。第1?#24043;?#23556;3h后引颈处死小鼠,剪开胸腔,取出胸腺置于200目筛网上。用玻璃注射器针栓轻轻?#24515;ィ?#29992;5ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养基冲洗筛网,细胞重悬于离心管?#23567;?#29992;含0.5%胎牛血清的PBS洗涤1次。

  1.5 胸腺细胞表面抗原的标记

  取数量不小于106的胸腺细胞,离心后重悬于50μl染色缓冲?#28023;?.5%胎牛血清/0.5%吐温-20/PBS)。加入PE Mouse Anti-CD4和PE-Cy5 Mouse Anti-CD8,室温避光孵育30min,加入染色缓冲液洗涤1次。

  1.6 细胞的固定与透化

  将胸腺细胞缓慢重悬于1ml新鲜配制的2%多聚甲醛中,4℃过夜。过?#36141;?#27927;涤1次,0.1%Tritonx-100/0.1%柠檬酸钠/PBS(pH7.2)重悬,冰上孵育2min,增加细胞膜通透性。

  1.7 DNA变性

  透化的胸腺细胞经离心后加入300μl DNaseΙ缓冲?#28023;?#27599;300μl缓冲液含有50U DNaseⅠ)重悬,37℃孵育30min,裂解DNA双链。

  1.8 BrdU抗体标记

  加入50μl染色缓冲液重悬,分别加入FITC Mouse Anti-BrdU或同型对照(FITC Mouse IgG1 КIsotype Control),4℃避光孵育30min。染色缓冲液洗涤1次,PBS重悬,24h内上机检验。

  1.9 流式细胞术分析

  应用流式细胞仪FACS Calibur进行检测,激发光为氩离子激光488nm谱线。Cellquest收集细胞,Flow Jo7.2.5软件分析流式结果。

  1.10 统计方法

  结果以T细胞内阳性细胞百分率的均数±SEM表示,双尾t检验比较组间差异,以P<0.05为显着性界限。

  2、结果

  胸腺细胞染色后?#26579;?#36807;前向角(FSC)和测向角散射光(SSC)分析(图1a),细胞大小均一,细胞聚集、碎片较少。去除细胞黏连和细胞碎片,分析选中的细胞群。BrdU抗体染色可见细胞BrdU-未增殖细胞和BrdU+增殖细胞区分明显(图1b)。选择BrdU+/SSC设门划定增殖细胞。小鼠胸腺细胞的增殖比率为14.58%±0.88%(图1c,n=5)。通过同时分析FL2-H和FL3-H双通道,检测胸腺细胞CD4和CD8表面抗原的分布。CD4SP(CD4+CD8-)细胞亚群位于左上方区域,占胸腺细胞整体的比例为17.16%;DP(CD4+CD8+)细胞亚群位于右上方区域,比例为70.56%;DN(CD4-CD8-)细胞亚群位于右下方区域,比例为3.45%、CD8SP(CD4-CD8+)细胞位于右下方区域,比例为10.12%。

  选择BrdU+/SSC分别对四个细胞亚群进行分析,其中BrdU+细胞比率为增殖细胞比率。细胞亚群BrdU-、BrdU+细胞群区分明显,能很好地反映掺入BrdU的DNA含量。CD4SP、DP、DN、CD8SP亚群细胞增殖比?#21490;?#21035;为2.52%、15.61%、27.26%、20.65%(图2)。结果显示,经过多聚甲醛、Tritonx-100、DNaseⅠ处理的细胞(Group1),其表面抗原标记与未经这些处理、仅标记表面抗原的细胞(Group2),其细胞亚群比例无显着性区别(表1)。

  3、讨论

  细胞增殖是评价细胞功能的常用指标之一。目前细胞增殖有多种检测方法,如3H-TdR掺入法,MTT染料掺入法等[5-6],其不足之处在于无法得到单细胞水平DNA合成情况,并且不能同时进行细胞表型的标记,因此无法得到不同细胞亚群的增殖情况。近年来,随着流式细胞仪技术的不断发展,BrdU掺入法已被用于检测单细胞水平的增殖情况。BrdU与胸腺嘧啶结构相似,其特点是胸腺嘧啶Ⅲ期嘧啶环与5位C连结的甲基被Br代替,在DNA合成过程中同胸腺嘧啶一样能掺入DNA双链。细胞样本经固定、通透、DNA解链后,通过检测BrdU的标记便能定性、定量地反映细胞的增殖状态。该方法必须的步骤是在活体动物或细胞中加入一定浓度的BrdU,使用通透剂透化细胞膜、并以一定浓度的DNA变性剂解链胞内DNA,从而加强抗体与BrdU的亲和力。此方法的难点在于透化细胞膜与解链DNA的同时,需要保持细胞表面蛋白结?#36141;?#19982;膜表面抗原结合的荧光强度不受影响[7]。目前国内运用流式细胞术检测BrdU通常采用70%乙醇透化细胞膜,2mol/LHCl变性DNA的方法,此法的特点为处理过程简便、经济,能够有效的检测BrdU标记的细胞,但有可能引起细胞的凝聚及非特异吸附[4],并且70%乙?#25216;?MHCl对膜表面抗原结合的荧光染料有较大的破坏作用,不?#35270;?#20110;同时标记膜表面抗原与BrdU的细胞样本检测。而国际常用的BrdU检测试剂盒,采?#26790;?#21644;的方法进行破膜及DNA变性,避免了对膜表面结合抗体荧光强度的影响,且操作过程简便。但进口试剂盒的购买周期长,价格昂贵,难于在广泛的应用于大量样品的检测。

  本文改进的方法是在细胞进行表面抗原标记后,用2%多聚甲醛固定细胞,0.1%Tritonx-100/0.1%柠檬酸钠透化细胞膜,?#23460;?#27987;度的DNaseⅠ解开DNA双链。其优点在于水溶液中的多聚甲醛易溶于脂类物质,能穿过细胞膜进入细胞内。用多聚甲醛固定细胞时,能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联。当不同的分子发生交联时,形成网状结构,把细胞的各个结构成分连接起来。低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持,可以使抗体更好地与抗原中的某些结合部位接触。但是单独使用多聚甲醛固定细胞不能使抗体进入细胞内,因此,细胞固定后必须用非离?#26377;?#34920;面活性剂透化细胞。Tritonx-100是一种较温和的非离?#26377;?#34920;面活性剂,它能溶解细胞膜上的脂质,增强细胞通透性,提高细胞膜对抗体的通透性,因此本文采用0.1%Tritonx-100温和的透化细胞膜。DNaseⅠ能够温和的裂解DNA双链,与多聚甲醛、Tritonx-100联?#40092;?#29992;,使掺入到DNA双链中的BrdU充分暴露,与抗体有效结合,既能?#26082;?#26816;测BrdU阴性和阳性细胞的比例,同时避免了细胞处理过程与膜表面抗原标记的冲突,能够?#26082;?#30340;分析细胞表面抗原的表达。相比乙醇、HCl法,避免了细胞处理过程对膜表面结合抗体荧光的影响;相比试剂盒法,则更为经济,且处理方法简洁。

  本方法获得了?#26082;貳?#37325;复性好流式细胞仪分析结果。结合不同的表面抗原标志,可以分析CD4SP、CD8SP、DN、DP等BrdU的掺入量,?#26082;?#21028;定不同细胞亚群的增殖状态。用流式细胞仪测定BrdU掺入的细胞增殖具有快速、简便、客观和定量?#26082;?#31561;优点,所得结果可靠、重复性好,可以替代乙醇、HCl检测法和试剂盒检测法,对同时标记的细胞膜表面抗原无影响,为检测不同亚型的细胞增殖提供了一个可靠、简单、有效的方法。

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